Az 1933-ban Budapesten született Barlay Zsuzsa korán kapcsolatba került a színpaddal: hároméves korától tizenöt éves koráig Lakner Bácsi Gyermekszínházában játszott. Először prózai szerepekben lépett fel, majd miután felfedezték énekhangját, a zenés darabok állandó szereplője lett.
1949 és 1957 között a budapesti Bartók Béla Zeneművészeti Szakközépiskola növendéke lett, ahol Molnár Bélánénál tanult énekelni. Közben 1952-től 1959-ig a Magyar Rádió Énekkarának tagja, majd 1959-től 1961-ig az Országos Filharmónia szólistája.
Az Operaház 1961-ben szerződtette, ahol Antónia anyja (Hoffmann meséi) szerepében debütált. Hamarosan itt aratta pályája legnagyobb sikerét (1965) Rossini Hamupipőkéjének címszerepében. A darabot kifejezetten az ő hangi, alkati, zenei és színészi adottságaira alapozva tűzték műsorra Békés András rendezésében.
Elsősorban komikus hősnői és karakterszerepekben csillogtatta kiváló képességeit, de drámai szerepekben is emlékezetes alakításokat nyújtott. Emlékezetes szerepei közé tartozott mások mellett Azucena (A turbadúr), Annina (Traviata), Arnalta (Poppea megkoronázása), Berta (A sevillai borbély), Czipra (A cigánybáró), Erda (A Rajna kincse, Siegfried), Fjodor (Borisz Godunov), Hunyadi Mátyás (Hunyadi László), Marcellina (Figaro házassága), Nancy (Márta), Olga (Anyegin), a szomszédasszony (Székely fonó), Szuzuki (Pillangókisasszony), Ulrica (Az álarcosbál), Zita anyó (Gianni Schicchi). 1989-es nyugdíjazását követően még 1992-ig énekelte Annina szerepét vendégművészként. A Magyar Televízióban is számos nagysikerű produkció készült a közreműködésével: A csengő (Donizetti), A tenor (Dohnányi), Vendégség (Tamássy Zdenko), A sevillai borbély (Rossini), Bösendorfer (Hidas Frigyes), Névtelen hősök (Erkel).
Barlay Zsuzsa részt vett kortárs magyar művek, úgymint Szokolay Sándor Néger kantáta és Vérnász, Ránki György Az ember tragédiája és A holdbéli csónakos operák bemutatásában. Fontos volt a hangversenyéletben betöltött szerepe is, a ’60-as évektől a hazai koncerteknek állandó közreműködője lett.
Nagy sikerrel énekelte többek között Vivaldi Juditha triumphans-át (melynek lemezfelvétele Párizsban nagydíjat nyert), Stravinsky Oedipus Rexét, Bach Máté-passióját és h-moll miséjét, Verdi Requiemjét vagy Liszt Krisztus című oratóriumát, amiben a Vatikánban II. János Pál pápa előtt is közreműködött. Emellett vendégszerepelt Prágában, Moszkvában, Bernben, Hamburgban, Nápolyban, Rómában és Párizsban.
Partnere volt olyan világsztároknak, mint Nicola Rossi-Lemeni (Borisz Godunov), Dietrich Fischer-Dieskau (Liszt: Krisztus), Nikola Nikolov (A trubadúr), Luigi Alva (A sevillai borbély), Nicolai Gedda (Faust), Jevgenyij Nyesztyerenko (Borisz Godunov, Anyegin, Faust, A sevillai borbély) és Renata Scotto (Pillangókisasszony, Traviata).
Barlay Zsuzsa munkásságát 1967-ben Liszt-díjjal, 1983-ban Érdemes művészi címmel, 1994-ben a Magyar Köztársasági Érdemrend tisztikeresztjével ismerték el. A Magyar Állami Operaház örökös tagjai 2015-ben választották soraikba.
